農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第813號(hào)
時(shí)間：2024-08-22 來源：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部
為進(jìn)一步加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥研究指導(dǎo)工作，規(guī)范新獸藥研究活動(dòng)，加快獸藥產(chǎn)品創(chuàng)新和上市應(yīng)用，根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》等有關(guān)規(guī)定，我部組織修訂了《水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》等5個(gè)獸藥技術(shù)指導(dǎo)原則，制定了水生動(dòng)物疫苗實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)和效力試驗(yàn)等2個(gè)獸藥技術(shù)指導(dǎo)原則，現(xiàn)予發(fā)布，請(qǐng)參照?qǐng)?zhí)行。原農(nóng)業(yè)部公告第2017號(hào)同時(shí)廢止。
特此公告。
附件：
1.水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
2.水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物田間藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
3.水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)（殺）蟲藥物藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
4.水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)（殺）蟲藥物田間藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
5.水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
6.水生動(dòng)物疫苗實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
7.水生動(dòng)物疫苗實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
農(nóng)業(yè)農(nóng)村部
2024年8月7日
水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則 水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)抗菌藥物防治水產(chǎn)動(dòng)物目標(biāo)適應(yīng)證的效果和發(fā)現(xiàn)可能存在的不良反應(yīng)，以確定藥物的有效性和給藥方案。 本指導(dǎo)原則適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物的藥效試驗(yàn)(II 期臨床試驗(yàn)),僅代表目前對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)研究的一般性認(rèn)識(shí)，旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)研究者和注冊(cè)申請(qǐng)人制訂、實(shí)施與監(jiān)督藥效臨床試驗(yàn)等提供技術(shù)指導(dǎo)和參考。 試驗(yàn)應(yīng)遵循《獸藥臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》(獸藥 GCP)的規(guī)定。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循“隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)”的基本原則。隨機(jī),即按機(jī)遇原則進(jìn)行分組、取樣和試驗(yàn);對(duì)照，進(jìn)行試驗(yàn)研究必須設(shè)立對(duì)照組,通過對(duì)照來鑒別處理因素與非處理因素之間的差異，抵消或減少試驗(yàn)誤差;重復(fù),即實(shí)驗(yàn)要有足夠的樣本含量,有重復(fù)的例數(shù)和平行操作,且試驗(yàn)結(jié)果要有重現(xiàn)性。此外還應(yīng)考慮均衡原則,均衡就是使對(duì)照組與試驗(yàn)組中的非處理因素盡量達(dá)到均衡一致,使處理因素的試驗(yàn)效應(yīng)能更真實(shí)地反映出來。 不同的抗菌藥物作用機(jī)制不同,各有特點(diǎn),本指導(dǎo)原則不可能涵蓋水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)研究的全部實(shí)際情況,開展藥效試驗(yàn)研究時(shí)應(yīng)結(jié)合受試藥物的自身特點(diǎn)、受試動(dòng)物及其感染疾病的種類,遵循“具體問題具體分析”的原則,根據(jù)實(shí)際情況確定藥效試驗(yàn)的內(nèi)容和順序。 每個(gè)試驗(yàn)水體應(yīng)能保持環(huán)境穩(wěn)定,不受外界環(huán)境變化或污染的影響,且相對(duì)獨(dú)立。試驗(yàn)水體必須能滿足水產(chǎn)動(dòng)物的生理要求,單位試驗(yàn)水體體積一般不小于 100L,放養(yǎng)密度應(yīng)控制在不影響受試動(dòng)物正常生理活動(dòng)的范圍。試驗(yàn)用水的水質(zhì)應(yīng)符合 GB11607《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》要求,自來水應(yīng)曝氣 48h 以上,天然水應(yīng)自然沉淀 24h 再過濾后使用。一般應(yīng)在以下表格中規(guī)定的條件下進(jìn)行試驗(yàn),特殊情況下按自然發(fā)病水溫進(jìn)行試驗(yàn)。
必要時(shí)可采取充氣、換水、控溫等措施以滿足受試動(dòng)物必要的正常生長(zhǎng)條件,試驗(yàn)期間應(yīng)按要求定期測(cè)定并記錄水溫、pH、溶解氧或鹽度(海水) 等參數(shù),試驗(yàn)用水的排放應(yīng)符合獸藥 GCP 相關(guān)要求。 根據(jù)試驗(yàn)的具體要求,合理選擇相應(yīng)種類的健康水產(chǎn)動(dòng)物,受試動(dòng)物來源于規(guī)范的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)單位。試驗(yàn)前應(yīng)在試驗(yàn)環(huán)境暫養(yǎng) 1 ~2 周。試驗(yàn)用水產(chǎn)動(dòng)物數(shù)量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求,一般規(guī)定每個(gè)試驗(yàn)組設(shè) 3 個(gè)平行,每個(gè)平行的試驗(yàn)動(dòng)物最低數(shù)量:魚類幼體 30 尾,成體 15 尾;蝦、蟹、貝、參類幼體(變態(tài)后與成體相似的幼體)40 只,成體 20 只;龜、鱉、蛙類幼體(變態(tài)后與成體相似的幼體)20 只,成體 10 只。 1． 受試藥物及來源。受試藥物應(yīng)與擬上市的制劑完全一致,有相應(yīng)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。受試藥物應(yīng)采用一定規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)批次樣品,產(chǎn)品處方、制備工藝、設(shè)備應(yīng)與最終生產(chǎn)條件一致,并在GMP 車間生產(chǎn)。受試藥物需有名稱、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格)、貯藏條件等信息,并具有農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。 2． 對(duì)照藥物及來源。對(duì)照藥物應(yīng)當(dāng)已在我國批準(zhǔn)上市,與受試藥物作用相似、適應(yīng)證相同的藥物。對(duì)照藥物由申報(bào)單位提供,并提供農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。無符合要求的對(duì)照藥物時(shí),選擇安慰劑作為對(duì)照藥物。 采用的疾病模型包括人工感染和自然感染兩種,可能的情況下,盡量采用人工感染。 1． 人工感染。感染用的菌種應(yīng)為具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)致病菌種或?qū)I(yè)機(jī)構(gòu)鑒定保藏的菌種。如果采用自然感染病例分離的菌株,應(yīng)詳細(xì)記錄其來源,并應(yīng)經(jīng)專業(yè)科研或檢測(cè)機(jī)構(gòu)鑒定方可用于試驗(yàn)。攻毒前需測(cè)定其包括受試藥物和對(duì)照藥物(但不限于受試藥物和對(duì)照藥物)在內(nèi)的最低抑菌濃度(MIC),必要時(shí)測(cè)定最低殺菌濃度(MBC)。感染前需進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。感染途徑可采用注射、浸浴和涂抹病原菌等感染方式。感染量以能使 80% 以上感染動(dòng)物死亡或出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀的劑量為最佳。試驗(yàn)菌株經(jīng)培養(yǎng)后配制成一定濃度的菌液,按照預(yù)實(shí)驗(yàn)確定感染途徑和感染量進(jìn)行感染。 也可采用與自然感染水產(chǎn)動(dòng)物同居進(jìn)行感染,但應(yīng)對(duì)所用的自然感染水產(chǎn)動(dòng)物的致病菌進(jìn)行分離鑒定,以便確診病原。 人工感染的病例需通過發(fā)病過程和臨床癥狀診斷,證明水產(chǎn)動(dòng)物已感染接種致病菌并發(fā)病后才能作為試驗(yàn)病例。通過臨床癥狀不能診斷的,可通過對(duì)致病菌的分離鑒定進(jìn)一步確診。 2． 自然感染。應(yīng)制訂自然感染病例入選條件。通過發(fā)病過程、臨床癥狀、病理剖檢、致病菌的分離鑒定,或血清學(xué)診斷,確診為試驗(yàn)所需致病菌感染的發(fā)病動(dòng)物才能作為試驗(yàn)病例,各組試驗(yàn)病例的發(fā)病嚴(yán)重程度應(yīng)基本一致。 應(yīng)采用隨機(jī)分組原則,試驗(yàn)組數(shù)取決于抗菌藥物的類型、疾病的特征以及有效劑量的篩選等因素,臨床試驗(yàn)一般應(yīng)滿足如下要求: 3． 對(duì)照藥物組,應(yīng)按照批準(zhǔn)的給藥方案給藥; 4． 受試藥物組,根據(jù)受試藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、體外抑菌試驗(yàn)以及劑量篩選的試驗(yàn)結(jié)果初步確定的給藥劑量,至少設(shè)高、中、低三個(gè)劑量組,中劑量一般為擬推薦劑量。 如受試藥物為復(fù)方制劑,應(yīng)根據(jù)組方中各主要成分,分別增設(shè)單方藥物的推薦劑量對(duì)照組。 臨床試驗(yàn)采用受試藥物擬推薦的給藥途徑,注射給藥應(yīng)標(biāo)明注射部位。若受試藥物有多種給藥途徑,應(yīng)該對(duì)每種給藥途徑分別進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)受試藥物特性和藥代動(dòng)力學(xué)、體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果制定合理的給藥劑量、頻次和療程。 一般要求在感染后個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)癥狀即開始給藥;自然感染病例在病因確診后開始給藥。 結(jié)合受試抗菌藥物的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特性、受試水產(chǎn)動(dòng)物、藥效試驗(yàn)研究方案等確定觀察時(shí)間點(diǎn)和觀察時(shí)長(zhǎng)。一般要求在停止給藥后還應(yīng)繼續(xù)觀察 7 天以上。 試驗(yàn)期間每天觀察和記錄各組受試水產(chǎn)動(dòng)物的發(fā)病時(shí)間、發(fā)病數(shù)、死亡時(shí)間、死亡數(shù)或存活數(shù)、癥狀出現(xiàn)或消失數(shù)等,同時(shí)注意采食量和行為的觀察。對(duì)于試驗(yàn)期間死亡動(dòng)物須進(jìn)行病理檢查或病原菌分離,以確認(rèn)受試動(dòng)物是否因病原菌感染引起,如因其它原因死亡的,統(tǒng)計(jì)時(shí)應(yīng)剔除。試驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)存活動(dòng)物進(jìn)行病理檢查。 ( 一) 評(píng)價(jià)指標(biāo) 應(yīng)根據(jù)詳細(xì)的試驗(yàn)記錄,計(jì)算各組受試動(dòng)物發(fā)病率或死亡率、 發(fā)病率(% )= 發(fā)病動(dòng)物數(shù)/ 受試動(dòng)物數(shù)×100% ; 死亡率(% )= 死亡動(dòng)物數(shù)/ 受試動(dòng)物數(shù)×100% ; 有效率(% )= 癥狀好轉(zhuǎn)動(dòng)物數(shù)/ 發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100% ; 治愈率(% )= 癥狀消失動(dòng)物數(shù)/ 發(fā)病動(dòng)物數(shù)×100% 。 必要時(shí),也可以配合采用其它指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 1． 試驗(yàn)的可靠性。在整個(gè)試驗(yàn)中,對(duì)照藥物組必須有效,感染不給藥對(duì)照組死亡率≥80% 或發(fā)病率≥80% ,不感染不給藥對(duì)照組存活率≥90% ,否則試驗(yàn)需重做。 2． 試驗(yàn)的有效性。以發(fā)病率或死亡率、有效率和/ 或治愈率進(jìn)行判斷,并將受試藥物組間、受試藥物組與對(duì)照組(包括不感染不給藥對(duì)照組、對(duì)照藥物組或感染不給藥對(duì)照組)進(jìn)行比較,對(duì)結(jié)果進(jìn)行定性和定量的統(tǒng)計(jì)分析。常用的生物統(tǒng)計(jì)方法有 t 檢驗(yàn)、x2檢驗(yàn)、方差分析等,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選用。 3． 結(jié)論。根據(jù)臨床癥狀、病理學(xué)變化觀察和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果,確定受試藥物對(duì)本適應(yīng)證的有效劑量及臨床推薦劑量;并提出臨床應(yīng)用該藥物的注意事項(xiàng)、不良反應(yīng)等。 為公正、科學(xué)地評(píng)價(jià)藥物的臨床療效,試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括如下內(nèi)容: 2． 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn); 3． 試驗(yàn)設(shè)計(jì)者、負(fù)責(zé)人、主要試驗(yàn)人員及聯(lián)系方式; 4． 試驗(yàn)水質(zhì)條件:如水溫、溶解氧、pH、鹽度等; 5． 受試藥物需注明藥物名稱、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格),對(duì)照藥物還需注明用法用量; 6． 試驗(yàn)動(dòng)物的品種、來源、體重或體長(zhǎng)、年齡、健康狀況及檢疫情況等; 8． 試驗(yàn)觀察現(xiàn)象與結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與效果評(píng)價(jià)等; 12． 應(yīng)歸檔保存原始資料,并注明保存地點(diǎn)、聯(lián)系人及聯(lián)系電話。水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物田間藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則 水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物田間藥效試驗(yàn)用于進(jìn)一步驗(yàn)證水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物在實(shí)際生產(chǎn)條件下對(duì)靶動(dòng)物目標(biāo)適應(yīng)證的有效性和安全性。 本指導(dǎo)原則適用于水產(chǎn)動(dòng)物用抗菌藥物的田間藥效試驗(yàn),僅代表目前對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物田間藥效試驗(yàn)研究的一般性認(rèn)識(shí),旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物田間藥效試驗(yàn)研究者和注冊(cè)申請(qǐng)人制訂、實(shí)施與監(jiān)督臨床藥效試驗(yàn)等提供技術(shù)指導(dǎo)和參考。 試驗(yàn)應(yīng)遵循《獸藥臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》 (獸藥 GCP) 的規(guī)定。 田間藥效試驗(yàn)應(yīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行,參照水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)的試驗(yàn)方案,并結(jié)合實(shí)際養(yǎng)殖條件、環(huán)境情況和病情等綜合考慮。 水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物田間藥效試驗(yàn)的建立主要包括試驗(yàn)池、受試水產(chǎn)動(dòng)物和數(shù)量的選擇,試驗(yàn)藥物的說明,給藥方案以及觀察指標(biāo)的確定等。 ( 一 ) 試驗(yàn) 養(yǎng)殖單 元要求 田間試驗(yàn)須安排在歷年發(fā)病地區(qū),飼養(yǎng)規(guī)范,實(shí)驗(yàn)條件能得到有效控制的養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)養(yǎng)殖單元可為水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上所用的池塘、網(wǎng)箱及工廠化養(yǎng)殖車間等設(shè)施,每個(gè)試驗(yàn)養(yǎng)殖單元應(yīng)相對(duì)獨(dú)立,并配備必要的養(yǎng)殖工具和設(shè)施。同一區(qū)域內(nèi)試驗(yàn)池要求位置、面積、環(huán)境條件基本相似。養(yǎng)殖品種、放養(yǎng)密度、歷史條件和病史基本一致。 試驗(yàn)期間應(yīng)測(cè)定并記錄試驗(yàn)池水的水溫、溶解氧、pH 值、氨氮、亞硝酸鹽和鹽度(海水)等水質(zhì)指標(biāo)。 1． 數(shù)量。選用自然感染的水產(chǎn)動(dòng)物或人工控制感染的水產(chǎn)動(dòng)物,每個(gè)養(yǎng)殖單元水產(chǎn)動(dòng)物數(shù)應(yīng)不少于 300 尾(只),珍稀水產(chǎn)動(dòng)物視情況而定。 2． 品種。應(yīng)與受試藥物擬推薦應(yīng)用范圍相一致。不同靶動(dòng)物品種和不同適應(yīng)證應(yīng)分別進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)。應(yīng)測(cè)定并記錄放養(yǎng)動(dòng)物的種類、規(guī)格、比例、數(shù)量等指標(biāo)。 3． 抽檢動(dòng)物數(shù)。每個(gè)平行組分別在給藥前和給藥療程結(jié)束后進(jìn)行抽檢(必要時(shí),需在觀察過程中抽檢一次),隨機(jī)抽取水產(chǎn)動(dòng)物的最低檢查數(shù)量應(yīng)不低于 15 尾(只)。 1． 受試藥物及來源。受試藥物應(yīng)與擬上市的制劑完全一致,有相應(yīng)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。受試藥物應(yīng)采用一定規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)批次樣品,產(chǎn)品處方、制備工藝、設(shè)備應(yīng)與最終生產(chǎn)條件一致,并在GMP 車間生產(chǎn)。 受試藥物需注明其名稱、主要輔料、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格)、保存條件,并提供農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。 2． 對(duì)照藥物及來源。對(duì)照藥物應(yīng)當(dāng)已在我國批準(zhǔn)上市,與受試藥物靶動(dòng)物以目為分類基礎(chǔ)相似、作用相似、適應(yīng)證相同。對(duì)照藥物由申報(bào)單位提供,并提供農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。無符合要求的對(duì)照藥物時(shí),選擇安慰劑作為對(duì)照藥物。 選擇的自然感染病例應(yīng)通過發(fā)病過程、臨床癥狀、病理剖檢、致病菌的分離鑒定或者快速診斷來確診,只有符合試驗(yàn)所需致病菌感染的發(fā)病動(dòng)物才能作為試驗(yàn)病例,各組試驗(yàn)病例的發(fā)病嚴(yán)重程度應(yīng)基本一致。每個(gè)單元確診不少于 5 尾。 田間藥效的試驗(yàn)組數(shù)取決于抗菌藥物的類型和疾病的特征,也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室藥效試驗(yàn)的結(jié)果來確定。 試驗(yàn)分組應(yīng)設(shè)對(duì)照藥物組和受試藥物組,條件允許的情況下,設(shè)置不給藥對(duì)照組,受試藥物組設(shè) 2 ~ 3 個(gè)平行。對(duì)于有推薦劑量范圍的,至少設(shè)高、低二個(gè)劑量組。 根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物藥效試驗(yàn)確定的用法和用量進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)期間不得使用其他藥物。 治療試驗(yàn)在停止給藥后繼續(xù)觀察不得少于 7 天。 試驗(yàn)期間每天觀察和記錄各組受試水產(chǎn)動(dòng)物的攝食量、活動(dòng)狀態(tài)、癥狀、死亡數(shù)和死亡時(shí)間等,并進(jìn)行分析。同時(shí)觀察和記錄試驗(yàn)期間動(dòng)物可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。必要時(shí),對(duì)受試動(dòng)物進(jìn)行病理檢查和病原分離,以確認(rèn)受試動(dòng)物是否因目標(biāo)病原菌感染發(fā)病,如因其它原因死亡的,統(tǒng)計(jì)時(shí)應(yīng)剔除。 四、數(shù)據(jù)處理及效果評(píng)價(jià) 應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)記錄計(jì)算各組試驗(yàn)動(dòng)物的死亡率或治愈率。其計(jì)算公式如下: 死亡率(% )= 死亡動(dòng)物數(shù)/ 受試動(dòng)物數(shù)×100% ; 治愈率(% )= (用藥前抽檢發(fā)病率-用藥后抽檢發(fā)病率) / 用藥前抽檢發(fā)病率×100% ; 1． 試驗(yàn)的可靠性。在整個(gè)試驗(yàn)中,對(duì)照藥物組必須有效,否則試驗(yàn)需重做。 2． 試驗(yàn)的有效性。試驗(yàn)以死亡率或治愈率進(jìn)行判斷,計(jì)算每個(gè)受試藥物組每個(gè)平行的死亡率,并與對(duì)照藥物組進(jìn)行比較,對(duì)結(jié)果選擇合適的生物統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行分析,考察受試藥物組與對(duì)照藥物組的差異性。 3． 結(jié)論。根據(jù)攝食量、活動(dòng)狀態(tài)、癥狀和死亡率等,確認(rèn)受試藥物的推薦劑量;并提出或確認(rèn)臨床應(yīng)用該藥物的注意事項(xiàng)、不良反應(yīng)等。 為公正、科學(xué)地評(píng)價(jià)藥物的臨床療效,試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括如下內(nèi)容: 2． 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn),天氣情況; 3． 試驗(yàn)設(shè)計(jì)者、負(fù)責(zé)人、主要試驗(yàn)人員及聯(lián)系方式; 4． 試驗(yàn)池塘需注明換水率,水溫、溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽氮、硬度、鹽度、等水質(zhì)條件; 5． 受試藥物需注明藥物名稱、主要輔料、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格),對(duì)照藥物還需注明用法用量; 6． 試驗(yàn)動(dòng)物的品種、來源、體重或體長(zhǎng)、年齡、健康狀況及檢疫情況等; 7． 試驗(yàn)分組、病例的確診、給藥方案等; 8． 試驗(yàn)觀察現(xiàn)象與結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與效果評(píng)價(jià)等;用藥后水體其他生物的異常情況; 12． 應(yīng)歸檔保存原始資料,并注明保存地點(diǎn)、聯(lián)系人及聯(lián)系電話。水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則 水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物的藥效試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)驅(qū)(殺)蟲藥物防治水產(chǎn)動(dòng)物目標(biāo)適應(yīng)證的效果和發(fā)現(xiàn)可能存在的不良反應(yīng),以確定藥物的有效性和給藥方案。 本指導(dǎo)原則適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物的藥效試驗(yàn)(II 期臨床試驗(yàn)),僅代表目前對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物藥效試驗(yàn)研究的一般性認(rèn)識(shí),旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物藥效試驗(yàn)研究者和注冊(cè)申請(qǐng)人制訂、實(shí)施與監(jiān)督藥效臨床試驗(yàn)等提供技術(shù)指導(dǎo)。 試驗(yàn)應(yīng)遵循《獸藥臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》(獸藥 GCP)的規(guī)定。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循“隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)”的基本原則。隨機(jī),即按機(jī)遇原則進(jìn)行分組、取樣和試驗(yàn);對(duì)照,進(jìn)行試驗(yàn)研究必須設(shè)立對(duì)照組,通過對(duì)照來鑒別處理因素與非處理因素之間的差異,抵消或減少試驗(yàn)誤差;重復(fù),即試驗(yàn)結(jié)果要有重現(xiàn)性,要有重復(fù)例數(shù)和平行操作,且試驗(yàn)結(jié)果要有重現(xiàn)性。此外還應(yīng)考慮均衡原則,均衡就是使對(duì)照組與試驗(yàn)組中的非處理因素盡量達(dá)到均衡一致,使處理因素的試驗(yàn)效應(yīng)能更真實(shí)地反映出來。 不同的驅(qū)(殺)蟲藥物作用機(jī)制不同,各有特點(diǎn),本指導(dǎo)原則不可能涵蓋水產(chǎn)動(dòng)物用驅(qū)(殺)蟲藥物藥效試驗(yàn)研究的全部實(shí)際情況,當(dāng)進(jìn)行藥效試驗(yàn)研究時(shí)應(yīng)結(jié)合該藥物的自身特點(diǎn)、試驗(yàn)水產(chǎn)動(dòng)物及其感染疾病的種類,遵循“具體問題具體分析”的原則,根據(jù)實(shí)際情況確定藥效試驗(yàn)的內(nèi)容和順序。 每個(gè)試驗(yàn)水體應(yīng)能保持環(huán)境穩(wěn)定、不受外界環(huán)境突然變化或污染影響,相對(duì)獨(dú)立。試驗(yàn)水體必須能滿足水產(chǎn)動(dòng)物的生理要求,單位試驗(yàn)水體體積一般不小于 100L,放養(yǎng)密度應(yīng)控制在不影響受試動(dòng)物正常生理活動(dòng)的范圍。 試驗(yàn)用水的水質(zhì)應(yīng)符合 GB11607《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》要求,自來水應(yīng)曝氣 48h 以上,天然水應(yīng)自然沉淀 24h 再過濾后使用。一般應(yīng)在以下表格中規(guī)定的條件下進(jìn)行試驗(yàn),特殊情況下按自然發(fā)病水溫進(jìn)行試驗(yàn)。 必要時(shí)可采取充氣、換水、控溫等措施滿足以上規(guī)定的試驗(yàn)條件,試驗(yàn)期間應(yīng)按要求定期測(cè)定并記錄水溫、pH、溶解氧或鹽度(海水)等參數(shù),試驗(yàn)用水的排放應(yīng)符合獸藥 GCP 相關(guān)要求。 根據(jù)試驗(yàn)的具體要求,合理選擇相應(yīng)種類的健康水產(chǎn)動(dòng)物,受試動(dòng)物來源于規(guī)范的水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)單位。試驗(yàn)前應(yīng)在試驗(yàn)環(huán)境暫養(yǎng) 1 ~2 周。 試驗(yàn)用水產(chǎn)動(dòng)物數(shù)量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求,一般規(guī)定每個(gè)試驗(yàn)組設(shè) 3 個(gè)平行,每個(gè)平行的試驗(yàn)動(dòng)物最低數(shù)量:魚類幼體(變態(tài)后與成體相似的幼體)30 尾,成體 15 尾;蝦、蟹、貝類幼體(變態(tài)后與成體相似的幼體)40 只,成體 20 只;龜、鱉、蛙類幼體(變態(tài)后與成體相似的幼體)20 只,成體 10 只。 1． 受試藥物及來源。受試藥物應(yīng)與擬上市的制劑完全一致,有相應(yīng)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。受試藥物應(yīng)采用一定規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)批次樣品,產(chǎn)品處方、制備工藝、設(shè)備應(yīng)與最終生產(chǎn)條件一致,并在GMP 車間生產(chǎn)。 受試藥物需有名稱、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格)、貯藏條件等信息,并具有農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。 2． 對(duì)照藥物及來源。對(duì)照藥物應(yīng)當(dāng)已在我國批準(zhǔn)上市,與受試藥物作用相似、適應(yīng)證相同的藥物。對(duì)照藥物由申報(bào)單位提供,并提供農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。無符合要求的對(duì)照藥物時(shí),選擇安慰劑作為對(duì)照藥物。 1． 人工感染。感染用的蟲種可以為臨床分離或采集的蟲種,應(yīng)詳細(xì)記錄其來源,且必須進(jìn)行嚴(yán)格的病原鑒定。感染前需進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。感染方法和途徑可根據(jù)寄生蟲體種類決定。感染量應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選擇原則上能使 90% 以上動(dòng)物感染的劑量,選取感染程度(癥狀表現(xiàn)、蟲體密度等特征) 基本一致的個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)。以損傷或致死性的方式才能觀察寄生蟲感染情況的個(gè)體,感染率原則上應(yīng)達(dá)到 70% 。
也可采用健康動(dòng)物與自然感染個(gè)體進(jìn)行同居感染,但應(yīng)對(duì)所用的自然感染個(gè)體的致病蟲體進(jìn)行分離鑒定,以便確定病原種類。 2． 自然感染。采用自然感染的水產(chǎn)動(dòng)物,應(yīng)制訂自然感染病例入選條件。通過臨床癥狀、病理剖檢、致病蟲種的鑒定,確診為試驗(yàn)所需致病蟲體感染的發(fā)病物才能作為試驗(yàn)病例,各組試驗(yàn)病例的發(fā)病嚴(yán)重程度應(yīng)基本一致。 人工感染和自然感染病例的確診。水產(chǎn)動(dòng)物體表及鰓絲感染的蟲體,試驗(yàn)前應(yīng)隨機(jī)抽取水產(chǎn)動(dòng)物樣品不少于 10 尾(只),輕輕刮取體表粘液或剪取小塊鰓絲涂片鏡檢,感染率原則上應(yīng)達(dá)到90% 以上。 水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)感染的蟲體,試驗(yàn)前應(yīng)隨機(jī)抽取水產(chǎn)動(dòng)物樣品不少于 10 尾(只),進(jìn)行剖殺后檢查組織或器官中蟲體數(shù),感染率原則上應(yīng)達(dá)到 70% 。 3． 體外殺蟲試驗(yàn)。特殊情況下,可進(jìn)行離體(體外) 殺蟲試驗(yàn)。 如中華鳋或多態(tài)錨頭鳋,采集成蟲若干,在適宜條件下孵化后,收集幼蟲進(jìn)行體外殺蟲試驗(yàn)。 試驗(yàn)組數(shù)取決于驅(qū)(殺)蟲藥物的類型、疾病的特征以及有效劑量的篩選等因素,試驗(yàn)應(yīng)滿足如下分組要求: 3．對(duì)照藥物組,應(yīng)按照批準(zhǔn)的給藥方案給藥; 4．受試藥物組,根據(jù)受試藥物劑量篩選的試驗(yàn)結(jié)果,確定給藥劑量,至少設(shè)高、中、低三個(gè)劑量組,中劑量一般為擬推薦劑量。如受試藥物為復(fù)方制劑,藥物對(duì)照組應(yīng)根據(jù)組方中各主要成分,分別設(shè)單方藥物的推薦劑量對(duì)照組。 臨床試驗(yàn)一般采用該藥擬推薦的給藥方案。受試藥物若有多種給藥方式,應(yīng)該對(duì)每種給藥方式分別進(jìn)行試驗(yàn)。 根據(jù)寄生蟲的生活史,結(jié)合受試藥物的藥效學(xué)、受試動(dòng)物、藥效試驗(yàn)研究方案等確定觀察時(shí)間點(diǎn)和觀察時(shí)長(zhǎng)。 一般要求在停止給藥后繼續(xù)觀察,口服驅(qū)蟲藥物時(shí)間不得少于 10 天,浸浴殺蟲藥物時(shí)間不得少于 7 天。 給藥前進(jìn)行寄生蟲學(xué)檢查,按不同種類的寄生蟲,分別檢查受試動(dòng)物的體表、鰓、血液、腸道等器官或組織,分類鑒定并計(jì)數(shù)。 給藥后及時(shí)觀察受試動(dòng)物健康狀況、行為特征和攝食情況,必要時(shí)進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢查。 記錄給藥前后每天動(dòng)物的死亡數(shù)。驅(qū)殺體表寄生蟲試驗(yàn)給藥后,應(yīng)定期隨機(jī)抽樣檢查蟲體存活情況,并分類鑒定計(jì)數(shù),同時(shí)記錄平均殘存蟲體數(shù)及殘存蟲體動(dòng)物數(shù)。 驅(qū)殺體內(nèi)寄生蟲試驗(yàn)結(jié)束后,將全部試驗(yàn)水產(chǎn)動(dòng)物剖殺,檢查殘存的蟲體或蟲卵,分類鑒定并計(jì)數(shù),同時(shí)記錄平均殘存蟲體數(shù)及殘存蟲體動(dòng)物數(shù)。 四、數(shù)據(jù)處理與效果評(píng)價(jià) 應(yīng)根據(jù)詳細(xì)的試驗(yàn)記錄,計(jì)算驅(qū)(殺)蟲率、驅(qū)凈率以及受試動(dòng)物的日死亡率、總死亡率。 公式如下: 驅(qū)(殺)蟲率(% )= (感染不給藥對(duì)照組平均殘留存活蟲體數(shù)-受試藥物組平均殘留存活蟲體數(shù)) / 感染不給藥對(duì)照組平均殘留存活蟲體數(shù)×100% ; 驅(qū)凈率(% )= 驅(qū)凈蟲體的動(dòng)物數(shù)/ 全部試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100% ; 日死亡率(% )= 每日死亡動(dòng)物數(shù)/ 全部試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100% ; 總死亡率(% ) = 試驗(yàn)期間死亡動(dòng)物總數(shù)/ 全部試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100% 。 1． 試驗(yàn)的可靠性。在整個(gè)試驗(yàn)中,對(duì)照藥物組必須有效,感染不給藥組感染率原則上應(yīng)達(dá)到 70% 以上,不感染不給藥組死亡率≤5% 。 2． 試驗(yàn)的有效性。將受試藥物組間、受試藥物組與對(duì)照藥物組進(jìn)行比較,對(duì)驅(qū)(殺) 蟲率、驅(qū)凈率、死亡率等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 評(píng)價(jià)指標(biāo)根據(jù)疾病發(fā)生的具體情況選擇。 常用的生物統(tǒng)計(jì)方法有 t 檢驗(yàn)、x 2 檢驗(yàn)和方差分析等,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選用。 3． 結(jié)論。確認(rèn)受試藥物對(duì)本適應(yīng)證的治療效果及其推薦劑量;并提出臨床應(yīng)用該藥物的注意事項(xiàng)、不良反應(yīng)以及藥物的相互作用等。 為公正、科學(xué)地評(píng)價(jià)藥物的臨床療效,試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括如下內(nèi)容: 2． 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn); 3． 試驗(yàn)設(shè)計(jì)者、負(fù)責(zé)人、主要試驗(yàn)人員及聯(lián)系方式; 4． 試驗(yàn)條件:如水溫、溶解氧、pH、鹽度等; 5． 受試藥物需注明藥物名稱、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格),對(duì)照藥物還需注明用法用量; 6． 試驗(yàn)動(dòng)物的品種、來源、體重或體長(zhǎng)、年齡、健康狀況及檢疫情況等; 8． 試驗(yàn)觀察現(xiàn)象與結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與效果評(píng)價(jià)等; 12． 應(yīng)歸檔保存原始資料,并注明保存地點(diǎn)、聯(lián)系人及聯(lián)系電話。水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物田間藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則 水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物的田間藥效試驗(yàn)用于進(jìn)一步驗(yàn)證水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物在實(shí)際生產(chǎn)條件下對(duì)靶動(dòng)物目標(biāo)適應(yīng)證的有效性和安全性。 本指導(dǎo)原則適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物的田間藥效試驗(yàn),僅代表目前對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物田間藥效試驗(yàn)研究的一般性認(rèn)識(shí),旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物田間藥效試驗(yàn)研究者和注冊(cè)申請(qǐng)人制訂、實(shí)施與監(jiān)督藥效臨床試驗(yàn)等提供技術(shù)指導(dǎo)和參考。 試驗(yàn)應(yīng)遵循《獸藥臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》 (獸藥 GCP) 的規(guī)定。 田間藥效試驗(yàn)應(yīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物藥效試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行,參照水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物藥效試驗(yàn)的試驗(yàn)方案,并結(jié)合實(shí)際養(yǎng)殖條件、環(huán)境情況和病情等綜合考慮。 (一) 試驗(yàn) 養(yǎng)殖單 元要求 田間試驗(yàn)須安排在歷年發(fā)病地區(qū),飼養(yǎng)規(guī)范,實(shí)驗(yàn)條件能得到有效控制的養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。 試驗(yàn)養(yǎng)殖單元可為水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上所用的池塘、網(wǎng)箱及工廠化養(yǎng)殖車間等設(shè)施,每個(gè)試驗(yàn)養(yǎng)殖單元應(yīng)相對(duì)獨(dú)立,并配備必要的養(yǎng)殖工具和設(shè)施。 同一區(qū)域內(nèi)試驗(yàn)池要求位置、面積、環(huán)境條件基本相似。 養(yǎng)殖品種、放養(yǎng)密度、歷史條件和病史基本一致。 試驗(yàn)期間應(yīng)測(cè)定并記錄試驗(yàn)池水的水溫、溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽和鹽度(海水)等水質(zhì)指標(biāo)。 1． 受試動(dòng)物要求。選用自然感染的水產(chǎn)動(dòng)物或人工控制感染的水產(chǎn)動(dòng)物,每個(gè)養(yǎng)殖單元水產(chǎn)動(dòng)物數(shù)應(yīng)不少于 300 尾(只),珍稀水產(chǎn)動(dòng)物視情況而定。 2． 品種。應(yīng)與受試藥物擬推薦應(yīng)用范圍相一致。不同靶動(dòng)物品種和不同適應(yīng)證應(yīng)分別進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)。 應(yīng)測(cè)定并記錄放養(yǎng)動(dòng)物的種類、規(guī)格、比例、數(shù)量等指標(biāo)。 3． 抽檢動(dòng)物數(shù)。每個(gè)平行組分別在給藥前和給藥療程結(jié)束后進(jìn)行抽檢(必要時(shí),需在觀察過程中抽檢一次),隨機(jī)抽取水產(chǎn)動(dòng)物的最低檢查數(shù)量應(yīng)不低于 15 尾(只)。 1． 受試藥物及來源。受試藥物應(yīng)與擬上市的制劑完全一致,有相應(yīng)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 受試藥物應(yīng)采用一定規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)批次樣品,產(chǎn)品處方、制備工藝、設(shè)備應(yīng)與最終生產(chǎn)條件一致,并在GMP 車間生產(chǎn)。 受試藥物需注明其名稱、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量( 或規(guī)格)、保存條件,并提供農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。 2． 對(duì)照藥物及來源。對(duì)照藥物應(yīng)當(dāng)已在我國批準(zhǔn)上市,與受試藥物作用相似、適應(yīng)證相同。 對(duì)照藥物由申報(bào)單位提供,并提供農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。 無符合要求的對(duì)照藥物時(shí),選擇安慰劑作為對(duì)照藥物。 水產(chǎn)動(dòng)物體表及鰓絲感染的蟲體,輕輕刮取體表粘液或剪取小塊鰓絲等病灶涂片鏡檢,確定給藥前的感染率和感染強(qiáng)度。 水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)感染的蟲體,進(jìn)行剖殺后檢查組織或器官中目標(biāo)蟲體數(shù),確定給藥前的感染率和感染強(qiáng)度。 田間藥效的試驗(yàn)組數(shù)取決于驅(qū)(殺)蟲藥物的類型和疾病的特征,也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室藥效試驗(yàn)的結(jié)果來確定。試驗(yàn)分組應(yīng)設(shè)對(duì)照藥物組和受試藥物組,條件允許的情況下,設(shè)置不給藥對(duì)照組,受試藥物組設(shè) 2 ~ 3 個(gè)平行。 對(duì)于有推薦劑量范圍的,至少設(shè)高、低二個(gè)劑量組。 根據(jù)水產(chǎn)養(yǎng)殖用驅(qū)(殺)蟲藥物藥效試驗(yàn)確定的用法和用量進(jìn)行試驗(yàn),受試藥物若有多種給藥方式,應(yīng)該對(duì)每種給藥方式分別進(jìn)行試驗(yàn)。 試驗(yàn)期間不得使用其他藥物。 根據(jù)寄生蟲的生活史,結(jié)合受試藥物的藥效學(xué)、受試動(dòng)物、藥效試驗(yàn)研究方案等確定觀察時(shí)間點(diǎn)和觀察時(shí)長(zhǎng)。 一般要求在停止給藥后繼續(xù)觀察,口服驅(qū)蟲藥物時(shí)間不得少于 10 天,浸浴殺蟲藥物時(shí)間不得少于 7 天。 給藥前進(jìn)行寄生蟲學(xué)檢查,按不同種類的寄生蟲,分別檢查受試動(dòng)物的體表、鰓、血液、腸道等器官或組織,分類鑒定并計(jì)數(shù)。給藥后及時(shí)觀察受試動(dòng)物健康狀況、行為、攝食以及死亡情況,并對(duì)死亡病例進(jìn)行剖檢。 必要時(shí)進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢查。 驅(qū)殺體表寄生蟲試驗(yàn)給藥后,應(yīng)定期隨機(jī)抽樣檢查蟲體存活情況,并分類鑒定計(jì)數(shù),同時(shí)記錄平均殘存蟲體數(shù)及殘存蟲體動(dòng)物數(shù)。 驅(qū)殺體內(nèi)寄生蟲試驗(yàn)結(jié)束后,將隨機(jī)抽取一定數(shù)量的試驗(yàn)水產(chǎn)動(dòng)物進(jìn)行剖殺,檢查殘存的蟲體或蟲卵,鑒定并分類計(jì)數(shù),同時(shí)記錄平均殘存蟲體數(shù)及殘存蟲體動(dòng)物數(shù)。 四、數(shù)據(jù)處理與效果評(píng)價(jià) 應(yīng)根據(jù)詳細(xì)的試驗(yàn)記錄,計(jì)算驅(qū)(殺)蟲率、驅(qū)凈率以及受試動(dòng)物的日死亡率。 公式如下: 驅(qū)(殺)蟲率(% )= (用藥前平均殘留存活蟲體數(shù)-用藥后平均殘留存活蟲體數(shù)) / 用藥前平均殘留存活蟲體數(shù)×100% ; 驅(qū)凈率(% )= (用藥前抽檢帶蟲率-用藥后抽檢帶蟲率) / 用藥前抽檢帶蟲率×100% ; 日死亡率(% )= 每日死亡動(dòng)物數(shù)/ 全部試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100% ; 總死亡率(% ) = 試驗(yàn)期間死亡動(dòng)物總數(shù)/ 全部試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100% 。 1． 試驗(yàn)的可靠性。在整個(gè)試驗(yàn)中,對(duì)照藥物組必須有效,否則試驗(yàn)需重做。 2． 試驗(yàn)的有效性。將受試藥物組間、受試藥物組與對(duì)照藥物組進(jìn)行比較,對(duì)驅(qū)(殺) 蟲率、驅(qū)凈率、死亡率等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 常用的生物統(tǒng)計(jì)方法有 t 檢驗(yàn)、x 2 檢驗(yàn)和方差分析等,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選用。 3． 結(jié)論。確認(rèn)受試藥物對(duì)本適應(yīng)證的治療效果及其推薦劑量;并提出或確認(rèn)臨床應(yīng)用該藥物的注意事項(xiàng)、不良反應(yīng)等。 為公正、科學(xué)地評(píng)價(jià)藥物的臨床療效,試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括如下內(nèi)容: 2． 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn),天氣情況; 3． 試驗(yàn)設(shè)計(jì)者、負(fù)責(zé)人、主要試驗(yàn)人員及聯(lián)系方式; 4． 試驗(yàn)水質(zhì)條件:如水溫、溶解氧、pH、鹽度等; 5． 受試藥物需注明藥物名稱、主要輔料、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格)、推薦使用的方法用量,對(duì)照藥物還需注明用法用量; 6． 試驗(yàn)動(dòng)物的品種、來源、體重或體長(zhǎng)、年齡、健康狀況及檢疫情況等; 7． 試驗(yàn)分組、病例的確診、給藥方案等; 8． 試驗(yàn)觀察現(xiàn)象與結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與效果評(píng)價(jià)等;用藥后水體其他生物的異常情況; 12． 應(yīng)歸檔保存原始資料,并注明保存地點(diǎn)、聯(lián)系人及聯(lián)系電話。水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則 水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑的藥效試驗(yàn)用于評(píng)價(jià)水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體外環(huán)境、工具及設(shè)施的消毒效果和(或)水產(chǎn)動(dòng)物目標(biāo)適應(yīng)證的防治效果的相關(guān)試驗(yàn),以確定消毒劑的有效性和合理使用方案,并發(fā)現(xiàn)可能存在的不良反應(yīng)。 本指導(dǎo)原則適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑的藥效試驗(yàn)(包括消毒效果試驗(yàn)和目標(biāo)適應(yīng)證的防治效果試驗(yàn)),僅代表目前對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑藥效試驗(yàn)研究的一般性認(rèn)識(shí),旨在為水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑藥效試驗(yàn)研究者和注冊(cè)申請(qǐng)人制訂、實(shí)施與監(jiān)督藥效臨床試驗(yàn)等提供技術(shù)指導(dǎo)和參考。 新研制、仿制及其復(fù)合型水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑需根據(jù)本指導(dǎo)原則要求完成全部消毒試驗(yàn)項(xiàng)目;已批準(zhǔn)在衛(wèi)生或陸生動(dòng)物上使用的消毒劑移植水產(chǎn)動(dòng)物使用時(shí),需完成實(shí)驗(yàn)室定性、定量消毒效果試驗(yàn)和現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn);國外注冊(cè)水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑需復(fù)核定量及現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn);以潑灑或藥浴方式用于養(yǎng)殖水體,并具有治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病功效的消毒劑除完成相關(guān)要求的消毒效果試驗(yàn)外,還需進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)。 試驗(yàn)應(yīng)遵循《獸藥臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》 (獸藥 GCP) 的規(guī)定。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循“隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)”的基本原則。隨機(jī),即按機(jī)遇原則進(jìn)行分組、取樣和試驗(yàn);對(duì)照,進(jìn)行試驗(yàn)研究必須設(shè)立對(duì)照組,通過對(duì)照來鑒別處理因素與非處理因素之間的差異,抵消或減少試驗(yàn)誤差;重復(fù),即試驗(yàn)要有足夠的樣本含量,有重復(fù)的例數(shù)和平行操作,且試驗(yàn)結(jié)果要有重現(xiàn)性。 此外還應(yīng)考慮均衡原則,均衡就是使對(duì)照組與試驗(yàn)組中的非處理因素盡量達(dá)到均衡一致,使處理因素的試驗(yàn)效應(yīng)能更真實(shí)地反映出來。 1． 菌毒種。試驗(yàn)用菌(毒)種應(yīng)為具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)致病菌(毒)種或?qū)I(yè)機(jī)構(gòu)鑒定保藏的菌(毒)種。 如果采用自然感染病例分離的菌株,應(yīng)詳細(xì)記錄其來源,并應(yīng)經(jīng)專業(yè)科研或檢測(cè)機(jī)構(gòu)鑒定方可用于試驗(yàn)。 在選擇消毒試驗(yàn)用的致病病毒株時(shí),注意所用病毒株應(yīng)代表一個(gè)很明確的病毒組,抵抗力強(qiáng),容易管理并可高滴度生長(zhǎng),且易于純化。 水產(chǎn)動(dòng)物臨床常見的、有代表性的菌(毒)種如下所示,根據(jù)消毒劑特定用途或試驗(yàn)特殊需要,可增選其它菌(毒)株。 (1) 細(xì)菌繁殖體。氣單胞菌(Aeromonas);愛德華氏菌( Ed-wardsiella);弧菌(Vibrio);鏈球菌(Streptococcus);黃桿菌(Flavobac-terium)。 (2)細(xì)菌芽孢?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)。 (3)真菌(根據(jù)用途選做)。水霉(Saprolegnia)。 2． 培養(yǎng)基。普通肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁肉湯培養(yǎng)基、馬丁瓊脂培養(yǎng)基、沙堡液體培養(yǎng)基、沙堡瓊脂培養(yǎng)基及其與試驗(yàn)菌種相對(duì)應(yīng)有特別要求的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基的選用和配制方法見獸藥典。 (1)受試消毒劑及來源。受試消毒劑應(yīng)與擬上市的制劑完全一致,有相應(yīng)的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 受試藥物應(yīng)采用一定規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)批次樣品,產(chǎn)品處方、制備工藝、設(shè)備應(yīng)與最終生產(chǎn)條件一致,并在 GMP 車間生產(chǎn)。受試消毒劑需注明其名稱、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格)、保存條件,并提供農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。 對(duì)照消毒劑應(yīng)當(dāng)已在我國批準(zhǔn)上市,與受試消毒劑作用相似、適應(yīng)證或用途相同。 由申報(bào)單位提供,并提供農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)部認(rèn)定的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的產(chǎn)品檢驗(yàn)合格報(bào)告。 4． 中和劑。選擇的中和劑應(yīng)對(duì)試驗(yàn)菌種無抑制作用,在最大試驗(yàn)濃度的消毒劑中加入中和劑后對(duì)試驗(yàn)菌種的抑制作用應(yīng)完全消除,此時(shí)中和劑的濃度可以作為本試驗(yàn)添加濃度。 常用消毒劑的中和劑參見下表。
試驗(yàn)菌(毒)種選用水產(chǎn)動(dòng)物臨床常見的、有代表性的菌(毒)種或目的(目標(biāo))菌(毒)種。 1． 實(shí)驗(yàn)室消毒能力測(cè)定試驗(yàn)一般分四組,即受試消毒劑組、對(duì)照消毒劑組、空白對(duì)照(不感染不處理)組和陰性對(duì)照(感染不處理)組。每組試驗(yàn)應(yīng)做 3個(gè)平行。 (1)定性測(cè)定。細(xì)菌、真菌孢子測(cè)定方法:先將制備好的菌液表：常用消毒劑的中和劑消毒劑（濃度） 中和劑（濃度）含氯（溴、碘）消毒劑（有效氯、溴或碘 0.1～0.5%）硫代硫酸鈉（0.1%～1.0%）過氧乙酸（0.1～0.5%） 硫代硫酸鈉（0.1%～0.5%）過氧化氫（1.0～3.0%） 硫代硫酸鈉（0.5%～1.0%）戊二醛（2%） 甘氨酸（1%）季銨鹽類消毒劑（0.1～0.5%） 吐溫 80（0.5～3.0%）洗必泰（0.1～0.5%） 卵磷酯（1.0～2.0%）含表面活性劑的各種復(fù)方消毒劑 吐溫 80（3.0%）酚類消毒劑（3.0～5.0%） 吐溫 80（3.0～5.0%）堿類消毒劑 等當(dāng)量酸酸類消毒劑 等當(dāng)量堿采用比濁法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),然后用 0． 03M 的 pH 為 7． 2 的磷酸鹽緩沖液稀釋成含菌 5×10 5 ~5×10 6 CFU/ ml 的試驗(yàn)菌液,取 9 支試管,每管加無菌蒸餾水 2． 5ml,于第 1 管加一定濃度的受試消毒劑溶液2． 5ml,混勻后,由第 1 管取 2． 5ml 至第 2 管,按二倍稀釋法依此類推,直至第 9 管,混合后取出 2． 5ml 棄去,向每管加 2． 5ml 試驗(yàn)菌液后置 20℃水浴中 5、10、30、60min 或其它特定的作用時(shí)間。以對(duì)照消毒劑溶液代替受試消毒劑溶液,同時(shí)進(jìn)行上述各步驟,作為對(duì)照消毒劑組;另取 2 支試管,進(jìn)行平行試驗(yàn),其中一管只加菌液不加消毒劑的作為陰性對(duì)照,另一管不做任何處理的作為空白對(duì)照。每管各取 0． 5ml 加入含足量中和劑的 4． 5ml 液體培養(yǎng)基中,混勻,中和 10min,再取出 0． 5ml 加入 4． 5ml 液體培養(yǎng)基內(nèi)。將接種菌株的培養(yǎng)基管置適宜溫度下培養(yǎng),若發(fā)生混濁即表示有細(xì)菌生長(zhǎng)。若肉湯不變混濁,應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至第 7d,若仍不混濁方可判為無菌生長(zhǎng)。 結(jié)果判定:以無菌生長(zhǎng)管消毒液的最低濃度為最低殺菌有效濃度,以無菌生長(zhǎng)管的最短消毒時(shí)間為該濃度殺菌最快有效時(shí)間。真菌菌絲測(cè)定方法在試驗(yàn)菌塊制備、接種、中和劑添加體積和結(jié)果觀測(cè)等方面應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。 (2)定量測(cè)定。細(xì)菌、真菌孢子測(cè)定方法:先將制備好的菌液采用比濁法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),然后用 0． 03M 的磷酸鹽緩沖液稀釋成含菌 10 6 ~10 7 CFU/ ml 的試驗(yàn)菌液;吸取 0．5ml 試驗(yàn)菌液分別于測(cè)試濃度的受試消毒劑和對(duì)照消毒劑溶液4． 5ml 內(nèi),置 20℃ 水浴5min 或其它特定的作用時(shí)間,立即分別吸取上述菌藥混合液1． 0ml,加入 9． 0ml 與受試消毒劑和對(duì)照消毒劑相對(duì)應(yīng)的中和液中混勻。以 0． 03M 的磷酸鹽緩沖液代替消毒劑溶液,同時(shí)進(jìn)行上述各步驟,作為陰性對(duì)照組;以不做任何處理的作為空白對(duì)照。中和10min 后采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行活計(jì)數(shù),計(jì)算殺菌率及殺滅指數(shù)。 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí),細(xì)菌繁殖體在適宜的溫度下培養(yǎng) 18 ~ 24h,觀察最終結(jié)果;細(xì)菌芽孢培養(yǎng)溫度為 37℃,培養(yǎng)時(shí)間一般為 72h 后觀察最終結(jié)果;真菌孢子在適宜的溫度下培養(yǎng) 24h ~ 72h 后觀察最終結(jié)果。 消毒 t 時(shí)的殺菌率(Pt)= ((n0-nt) / n0)×100% 以上兩式中:n0 為對(duì)照組活菌數(shù),nt 為實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)。 病毒測(cè)定方法:分別取不同濃度的消毒劑 4． 5ml 與適當(dāng)濃度的特定病毒溶液 0． 5ml 混合,置 20℃ 水浴 5min 或其它特定的作用時(shí)間,同時(shí)設(shè)生理鹽水或培養(yǎng)基為對(duì)照組。分別取上述各組溶液各 1ml,加入中和劑 9ml,混勻,作用 10min,倍比稀釋,每個(gè)稀釋度接種到敏感細(xì)胞上,測(cè)定其病毒滴度。 病毒滅活率% =(消毒前病毒滴度-消毒后病毒滴度) / 消毒前病毒滴度×100% 2． 養(yǎng)殖水體現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn)。在完成實(shí)驗(yàn)室定性、定量消毒能力測(cè)定的基礎(chǔ)上,進(jìn)行特定病原菌和自然菌養(yǎng)殖水體現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn)。根據(jù)消毒劑的殺菌性能及對(duì)水體理化指標(biāo)、靶動(dòng)物的影響程度,通過本試驗(yàn)確定實(shí)際使用方法、濃度及作用時(shí)間等。 (1)目標(biāo)病原菌養(yǎng)殖水體現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn)。 試驗(yàn)用水:應(yīng)符合 GB11607《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》要求,在 15d 以內(nèi)未使用過任何消毒劑的池塘中取 200L 養(yǎng)殖水,分別裝入 6 個(gè)水簇箱中,每箱 20L,試驗(yàn)前后測(cè)定并記錄水體的 pH、溶解氧、水溫、氨氮、亞硝酸鹽和鹽度(海水)等指標(biāo)。將特定病原菌制成菌液加入養(yǎng)殖水體中,使水體中菌液濃度為 10 5 ~10 6 CFU/ mL。 試驗(yàn)分組:受試消毒劑組 一般設(shè)高、中(推薦使用濃度)、低三個(gè)濃度受試消毒劑試驗(yàn)組。 測(cè)定方法:消毒前和消毒后 10、30、60min 或其它特定的作用時(shí)間采混勻后的各組水樣 1ml,迅速加入 9ml 中和液中混勻,采用平板菌落計(jì)數(shù)法分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算殺菌率。 結(jié)果判斷:殺菌率 = (消毒前活菌數(shù)-消毒后活菌數(shù)) / 消毒前活菌數(shù)×100% (2)養(yǎng)殖水體現(xiàn)場(chǎng)消毒試驗(yàn)。試驗(yàn)宜安排在歷年發(fā)病地區(qū),飼養(yǎng)規(guī)范,實(shí)驗(yàn)條件能得到有效控制的養(yǎng)殖場(chǎng)的三口池塘中進(jìn)行。每個(gè)試驗(yàn)池應(yīng)相對(duì)獨(dú)立,位置、水深、面積、環(huán)境條件基本相似。試驗(yàn)水體應(yīng)符合 GB11607《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》要求,在 15d 以內(nèi)未使用過任何消毒劑的養(yǎng)殖池塘水。試驗(yàn)期間應(yīng)測(cè)定并記錄試驗(yàn)水體的水溫、pH、溶解氧、透明度、氨氮、亞硝酸鹽和鹽度(海水)等水質(zhì)指標(biāo),同時(shí)觀察試驗(yàn)池中魚的攝食量、活動(dòng)狀態(tài)等。該試驗(yàn)只設(shè)受試消毒劑組,不設(shè)空白對(duì)照組和對(duì)照消毒劑組(由于每口池塘中的微生物種群、數(shù)量以及水體理化指標(biāo)有差異),根據(jù)受試消毒劑擬推薦的用法和用量進(jìn)行試驗(yàn),試驗(yàn)應(yīng)做 3個(gè)平行。消毒前和消毒后 30、60、120min 或其它特定的作用時(shí)間,沿試驗(yàn)池塘對(duì)角線選取 3 個(gè)點(diǎn)(對(duì)角線兩端離池塘邊角 3m 各 1 個(gè)點(diǎn),正中心 1 個(gè)點(diǎn)),用規(guī)格 1L 采水器分別于 3 個(gè)點(diǎn)的水面下 10 ~15cm 處(或其它特定要求的取樣點(diǎn))取水樣,然后混合,吸取混勻后的水樣 1ml 迅速加入 9ml 中和液中混勻,置 4℃處冷藏保存不得超過 6 小時(shí)。采用平板菌落計(jì)數(shù)法分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),計(jì)算殺菌率。 3． 影響消毒劑消毒效果因素試驗(yàn)。用于養(yǎng)殖水體的消毒劑,其藥效往往受目標(biāo)菌的種類、消毒劑濃度、消毒作用時(shí)間、消毒時(shí)的水溫、pH 值及有機(jī)物濃度等因素的影響。應(yīng)采用單因素試驗(yàn)法(即除被試因素外,其他有關(guān)因素都固定在常用水平上)進(jìn)行定量消毒試驗(yàn),測(cè)定不同影響因素、不同水平上的殺菌率,并互相比較。 4． 田間藥效試驗(yàn)。水產(chǎn)養(yǎng)殖用消毒劑以潑灑或藥浴方式用于養(yǎng)殖水體后,可通過體表和鰓等組織器官進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi),對(duì)體內(nèi)病原菌起到抗菌作用,具有治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病的功效,其藥效試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案參見《水產(chǎn)養(yǎng)殖用抗菌藥物田間藥效試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》。 1． 試驗(yàn)的可靠性。在整個(gè)試驗(yàn)中,對(duì)照消毒劑組必須有效;在實(shí)驗(yàn)室消毒能力測(cè)定試驗(yàn)中,陰性對(duì)照組必須有菌生長(zhǎng),空白對(duì)照不能有菌生長(zhǎng),否則試驗(yàn)需重做。 2． 測(cè)試消毒效能,其殺菌率或病毒滅活率應(yīng)達(dá) 99． 9% 以上。測(cè)試殺菌(滅毒)效能,其殺菌率或病毒滅活率須達(dá) 100% 。當(dāng)?shù)?/span>于此指標(biāo)時(shí),則應(yīng)提高消毒劑的濃度或延長(zhǎng)作用時(shí)間,重新試驗(yàn)。 3． 消毒效果。以殺菌率或病毒滅活率進(jìn)行判斷,并將受試消毒劑組間、受試消毒劑組與對(duì)照組(包括對(duì)照消毒劑組或感染不施消毒劑組)進(jìn)行比較,對(duì)結(jié)果進(jìn)行定性和定量的統(tǒng)計(jì)分析。常用的生物統(tǒng)計(jì)方法有 t 檢驗(yàn)、x 2 檢驗(yàn)、方差分析等,應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選用。 4． 結(jié)論。根據(jù)消毒效果統(tǒng)計(jì)結(jié)果,同時(shí)結(jié)合消毒劑對(duì)水體理化因子、靶動(dòng)物的影響情況以及影響消毒劑消毒效果因素試驗(yàn)結(jié)果,確認(rèn)受試消毒劑的推薦劑量;并提出或確認(rèn)臨床應(yīng)用該消毒劑的注意事項(xiàng)、不良反應(yīng)等。 為公正、科學(xué)地評(píng)價(jià)消毒劑的臨床療效,試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括如下內(nèi)容: 2． 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn); 3． 試驗(yàn)設(shè)計(jì)者、負(fù)責(zé)人、主要試驗(yàn)人員及聯(lián)系方式; 4． 試驗(yàn)水質(zhì)條件:如水溫、溶解氧、pH、鹽度等; 5． 受試消毒劑需注明消毒劑名稱、生產(chǎn)廠家、生產(chǎn)批號(hào)、含量(或規(guī)格),對(duì)照消毒劑還需注明用法用量; 6． 消毒能力定性與定量測(cè)定方法、養(yǎng)殖水體目標(biāo)菌與自然菌的消毒試驗(yàn)方法; 7． 影響消毒劑藥效因素試驗(yàn)方案(必要時(shí)); 8． 消毒劑田間藥效試驗(yàn)方案(必要時(shí)); 9． 試驗(yàn)觀察現(xiàn)象與結(jié)果、數(shù)據(jù)處理與效果評(píng)價(jià)等; 13． 應(yīng)歸檔保存原始資料,并注明保存地點(diǎn)、聯(lián)系人及聯(lián)系電話。 1． 消毒,是指用物理的、化學(xué)的或生物學(xué)的方法殺滅或清除外環(huán)境中的各種病原微生物,使之達(dá)到不至于引起疾病的數(shù)量。所謂“外環(huán)境”除包括無生命的固體物表面、液體和氣體外,也包括有生命的動(dòng)物機(jī)體的體表和淺表體腔。 2． 消毒劑,是主要用于殺滅外環(huán)境中病原微生物的化學(xué)藥物。 3． 抗菌,是指抑制動(dòng)物體內(nèi)微生物的生長(zhǎng)繁殖,或?qū)⑵錃纭?/span>主要指動(dòng)物全身用藥。水生動(dòng)物疫苗實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則 為水生動(dòng)物疫苗實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)研究提供原則性指導(dǎo)。 水生動(dòng)物疫苗的安全性是考察其質(zhì)量的最重要指標(biāo)之一。農(nóng)業(yè)部公告第 442 號(hào)對(duì)獸用疫苗制品的實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定。 實(shí)驗(yàn)室及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的生物安全條件應(yīng)符合國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)室生物安全標(biāo)準(zhǔn)。 1． 實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)應(yīng)使用靶動(dòng)物進(jìn)行。有充分資料證明與靶動(dòng)物安全試驗(yàn)結(jié)果有相關(guān)性時(shí),可使用其他敏感的水生動(dòng)物作為模式動(dòng)物。 2． 實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)中所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)健康易感,不攜帶影響試驗(yàn)結(jié)果判定的特定病原或特定抗體。必要時(shí)應(yīng)使用普通級(jí)或SPF 級(jí)易感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 3． 試驗(yàn)用動(dòng)物的種類、年齡、個(gè)體大小、體重和生理狀態(tài)(如性成熟)應(yīng)與疫苗說明書中擬規(guī)定的靶動(dòng)物相一致。試驗(yàn)用動(dòng)物的來源/ 遺傳背景應(yīng)盡量避免存在差異性。 4． 試驗(yàn)中應(yīng)使用敏感性高的品系。 5． 每批疫苗制品的實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)中所用水生動(dòng)物應(yīng)不少于 30 尾,來源困難或經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的動(dòng)物應(yīng)不少于 5 尾。 在疫苗接種期間,實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖用水的水質(zhì)參數(shù),如溫度和鹽度(如淡水與海水)應(yīng)與疫苗應(yīng)用的實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境相似。必要時(shí)應(yīng)設(shè)置合理的溫度梯度。 實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)中所用實(shí)驗(yàn)室制品的生產(chǎn)用菌(毒、蟲)種、制品組成和配方等,應(yīng)與規(guī)?；a(chǎn)的產(chǎn)品相同。實(shí)驗(yàn)室制品應(yīng)經(jīng)過必要的性狀、含量、純粹/ 純凈性等初步檢驗(yàn),且結(jié)果須在預(yù)期的可接受范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室制品中主要成分的含量應(yīng)不低于規(guī)?；?/span>生產(chǎn)時(shí)的出廠標(biāo)準(zhǔn)。 1． 在試驗(yàn)開始前,應(yīng)制定詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)方案,其內(nèi)容應(yīng)包括受試疫苗的種類,試驗(yàn)開始和結(jié)束的日期,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡、種類等特征,疫苗配方,對(duì)照組的設(shè)置,每組動(dòng)物的來源和數(shù)量、飼養(yǎng)條件、試驗(yàn)管理和觀察方式,結(jié)果的判定方法及標(biāo)準(zhǔn)等。 2． 試驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照組。如有對(duì)照疫苗,還可設(shè)對(duì)照疫苗組。 四、實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)的內(nèi)容和方法 可采用肉眼觀察和/ 或顯微鏡觀察方法,至少觀察 14 日。每日監(jiān)測(cè)試驗(yàn)用動(dòng)物的死亡、發(fā)病、全身和/ 或局部反應(yīng)情況。應(yīng)監(jiān)測(cè)和記錄所有不良反應(yīng)的性質(zhì)和頻率。 按照推薦的接種途徑,用適宜規(guī)格(日齡、體重或體長(zhǎng))的靶動(dòng)物,接種 1 個(gè)劑量,至少觀察 2 周。評(píng)估指標(biāo)應(yīng)包括臨床癥狀、局部炎癥、組織病變等。對(duì)于可用于多種動(dòng)物的疫苗制品,應(yīng)用各種靶動(dòng)物進(jìn)行安全試驗(yàn)。 (二)多次接種的疫苗制品應(yīng)進(jìn)行單劑量重復(fù)接種安全試驗(yàn) 有關(guān)要求同一次單劑量接種的安全試驗(yàn)。 按照一次單劑量接種的安全試驗(yàn)進(jìn)行,但接種劑量為推薦免疫劑量的數(shù)倍至一百倍不等。通常情況下,滅活疫苗的安全試驗(yàn)劑量為推薦免疫劑量的 2 倍,活疫苗的安全試驗(yàn)劑量為推薦免疫劑量的 10 ~100 倍。根據(jù)不同使用途徑選擇合適的劑量。 (四) 對(duì)共患病原微生物或已有文獻(xiàn)報(bào)道有共感染的非靶動(dòng)物、 非使用日齡靶動(dòng)物的安全試驗(yàn)(活疫苗可能適用) 有些病原可感染多種動(dòng)物或多個(gè)日齡段的動(dòng)物,這類制品的安全試驗(yàn)中,除應(yīng)考察疫苗制品對(duì)靶動(dòng)物和使用日齡靶動(dòng)物動(dòng)物的安全性外,還應(yīng)對(duì)非使用對(duì)象動(dòng)物和非使用日齡動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn),以考察對(duì)靶動(dòng)物群使用該疫苗制品后對(duì)非靶動(dòng)物群可能引起的安全風(fēng)險(xiǎn)。 (五) 疫苗水平傳播試驗(yàn)(活疫苗可能適用) 評(píng)估使用該類疫苗免疫后,對(duì)周圍飼養(yǎng)的同品種易感動(dòng)物的潛在危害性及其對(duì)環(huán)境的污染,為正確使用疫苗提供科學(xué)依據(jù)。 (六) 對(duì)靶動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響試驗(yàn) 對(duì)食用水生動(dòng)物的疫苗制品應(yīng)進(jìn)行本項(xiàng)試驗(yàn)。使用這類疫苗制品后,觀察記錄一定周期內(nèi)靶動(dòng)物的生長(zhǎng)情況,如體重變化、飼料系數(shù)等,評(píng)估疫苗制品對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能的影響。如果在一定試驗(yàn)周期內(nèi)無法評(píng)價(jià)對(duì)生產(chǎn)性能的影響,可用臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)代替。 用于制備水生動(dòng)物疫苗的一些非生物源性物質(zhì),如礦物油佐劑、鋁膠佐劑等,用于食品動(dòng)物后,可能對(duì)人類的生命健康造成危害,這類制品的安全試驗(yàn)中應(yīng)包括有關(guān)化學(xué)物質(zhì)在靶動(dòng)物體內(nèi)的殘留試驗(yàn),為制定該制品的休藥期提供必要的支持性數(shù)據(jù)。 上述實(shí)驗(yàn)室安全試驗(yàn)項(xiàng)目中,第(一)和(三)項(xiàng)試驗(yàn)通常是必不可少的,第(二)、(四)、(五)、(六)、(七)項(xiàng)試驗(yàn)有時(shí)不是必須的,應(yīng)根據(jù)疫苗制品的種類、性質(zhì)、靶動(dòng)物等具體情況選擇進(jìn)行。第(三)項(xiàng)內(nèi)容通常是制定成品安全檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的最直接依據(jù),應(yīng)有連續(xù) 3 批實(shí)驗(yàn)室疫苗制品的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。水生動(dòng)物疫苗實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則 為水生動(dòng)物疫苗實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)研究提供原則性指導(dǎo)。 水生動(dòng)物疫苗的免疫效力是考察其質(zhì)量的最重要指標(biāo)之一。農(nóng)業(yè)部公告第 442 號(hào)對(duì)獸用疫苗的實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定。 實(shí)驗(yàn)室及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的生物安全條件應(yīng)符合國家有關(guān)實(shí)驗(yàn)室生物安全標(biāo)準(zhǔn)。 (二) 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物的要求 1． 實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)應(yīng)使用靶動(dòng)物進(jìn)行。有充分資料證明與靶動(dòng)物效力試驗(yàn)結(jié)果有平行關(guān)系的,可使用其他動(dòng)物作為替代動(dòng)物。 2． 實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)中所用試驗(yàn)用動(dòng)物應(yīng)健康易感,不攜帶影響試驗(yàn)結(jié)果判定的特定病原或特定抗體。必要時(shí)應(yīng)使用普通級(jí)或SPF 級(jí)易感實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 3． 試驗(yàn)用動(dòng)物的種類、年齡、個(gè)體大小、體重和生理狀態(tài)(如性成熟)應(yīng)與疫苗說明書中擬規(guī)定的靶動(dòng)物相一致。試驗(yàn)用動(dòng)物的來源/ 遺傳背景應(yīng)盡量避免存在差異性。 4． 每批疫苗制品的實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)中所用水生動(dòng)物應(yīng)不少于 30 尾,來源困難或經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的動(dòng)物應(yīng)不少于 5 尾。 在疫苗接種期間,實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖用水的水質(zhì)參數(shù),如溫度和鹽度(如淡水與海水)應(yīng)與疫苗應(yīng)用的實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境相似。必要時(shí)應(yīng)設(shè)置合理的溫度梯度。 實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)中所用實(shí)驗(yàn)室疫苗制品的生產(chǎn)用菌(毒、蟲)種、制品組成和配方等,應(yīng)與規(guī)?；a(chǎn)的產(chǎn)品相同。實(shí)驗(yàn)室疫苗制品應(yīng)經(jīng)過必要的性狀、含量、純粹/ 純凈性等初步檢驗(yàn),且結(jié)果須在預(yù)期的可接受范圍內(nèi)。 為了同時(shí)證明產(chǎn)品“規(guī)程”中所規(guī)定的基礎(chǔ)種子使用代次范圍的合理性,通常用處于最高代次水平的病毒(或細(xì)菌)抗原制備疫苗后,進(jìn)行效力試驗(yàn)。一旦試驗(yàn)結(jié)果證明最高代次水平的疫苗具有令人滿意的免疫效果,則可認(rèn)為規(guī)定范圍內(nèi)的基礎(chǔ)種子均具有令人滿意的免疫原性。 如果每批規(guī)模化生產(chǎn)的產(chǎn)品出廠時(shí)的“效力檢驗(yàn)”采取與參考疫苗對(duì)比的方法,則在實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)中,除應(yīng)使用實(shí)驗(yàn)室制品進(jìn)行效力試驗(yàn)外,還應(yīng)用參考疫苗進(jìn)行系統(tǒng)的效力試驗(yàn)。 (五) 對(duì)攻擊用強(qiáng)毒的要求 1．在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)中可能會(huì)使用攻毒用強(qiáng)毒。對(duì)已經(jīng)有國家標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的,應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株,必要時(shí)增加使用當(dāng)時(shí)的流行株。對(duì)沒有國家標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株的,可使用自行分離的強(qiáng)毒株,但需報(bào)告其來源、歷史和有關(guān)鑒定結(jié)果。 2．使用高致病性病原微生物的,應(yīng)按有關(guān)規(guī)定事先獲得有關(guān)部門批準(zhǔn)。 1．在試驗(yàn)開始前,應(yīng)制定詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)方案,其內(nèi)容應(yīng)包括受試疫苗的種類,試驗(yàn)開始和結(jié)束的日期,試驗(yàn)用動(dòng)物的年齡、種類等特征,疫苗配方,對(duì)照組的設(shè)置,每組動(dòng)物的來源和數(shù)量、飼養(yǎng)條件、試驗(yàn)管理和觀察方式,結(jié)果的判定方法及標(biāo)準(zhǔn)等。 2．試驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照組。如有對(duì)照疫苗,還可設(shè)對(duì)照疫苗組。 四、實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)的內(nèi)容及方法 該方法是考察水生動(dòng)物疫苗免疫效力的常規(guī)方法。其基本方法是:用實(shí)驗(yàn)室疫苗制品接種一定數(shù)量的動(dòng)物,經(jīng)一定時(shí)間后,采用攻毒用強(qiáng)毒株同時(shí)對(duì)上述免疫動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物進(jìn)行攻毒,在攻毒后一定時(shí)間內(nèi),觀察動(dòng)物的發(fā)病或死亡情況,統(tǒng)計(jì)免疫及對(duì)照動(dòng)物發(fā)病率或死亡率,或計(jì)算相對(duì)保護(hù)率,評(píng)估制品的效力;必要時(shí),在觀察期結(jié)束時(shí),將所有動(dòng)物撲殺,進(jìn)行病理組織學(xué)檢查,有時(shí)還應(yīng)進(jìn)行病原分離,根據(jù)免疫動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物的眼觀病理學(xué)變化、組織病理學(xué)變化或病原分離情況評(píng)估制品的免疫效力。靶動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn)的具體方法可分為定量免疫定量強(qiáng)毒攻擊法、變量免疫定量強(qiáng)毒攻擊法、定量免疫變量強(qiáng)毒攻擊法等,具體試驗(yàn)中可根據(jù)疫苗制品和疾病的具體情況選擇一種或數(shù)種適宜方法。 1． 定量免疫定量強(qiáng)毒攻擊法。該方法中以定量的受試疫苗接種適宜動(dòng)物,經(jīng)一定時(shí)間后,用定量的強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊,觀察動(dòng)物接種后所建立的免疫力。 2． 定量免疫變量強(qiáng)毒攻擊法。該方法中將動(dòng)物分為兩大組,一為免疫組,一為對(duì)照組,兩大組又各分為相等的若干小組,每小組的動(dòng)物數(shù)相等。免疫組各小組動(dòng)物均用同一劑量的受試疫苗進(jìn)行免疫接種,經(jīng)一定時(shí)間后,與對(duì)照組一起,同時(shí)用不同稀釋度強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊,觀察、統(tǒng)計(jì)免疫組與對(duì)照組各小組的發(fā)病率、死亡率、病變率或感染率,分別計(jì)算免疫組與對(duì)照組的 LD50(或 ID50),比較免疫組與對(duì)照組動(dòng)物對(duì)不同劑量強(qiáng)毒攻擊的耐受力。 3． 變量免疫定量強(qiáng)毒攻擊法(PD50 試驗(yàn))。該方法中疫苗稀釋為不同的免疫劑量,并分別接種動(dòng)物,間隔一定時(shí)間待動(dòng)物的免疫力建立以后,各免疫組均用同一劑量的強(qiáng)毒攻擊,觀察一定時(shí)間,用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算能使 50% 的動(dòng)物得到保護(hù)的免疫劑量(PD50)。 4． 有關(guān)說明。如因動(dòng)物來源困難等導(dǎo)致無法用靶動(dòng)物建立適宜的攻毒模型,并有充分的科學(xué)依據(jù)證明采用替代動(dòng)物抗體測(cè)定法、替代動(dòng)物免疫攻毒法等其他方法與靶動(dòng)物免疫攻毒效力之間有一定相關(guān)性時(shí),可采用替代方法取代靶動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn)。 (二) 疫苗抗原( (細(xì) 細(xì)毒 菌或病毒) ) 含量與靶動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)力究相關(guān)性的研究( (最 最驗(yàn) 小免疫劑量試驗(yàn)) )疫苗內(nèi)抗原(細(xì)菌或病毒)含量與免疫攻毒保護(hù)率之間,在一定范圍內(nèi)通常存在明顯平行關(guān)系,可根據(jù)最小免疫劑量試驗(yàn)結(jié)果建立疫苗成品的抗原(細(xì)菌或病毒)含量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)符合抗原(細(xì)菌或病毒)含量標(biāo)準(zhǔn)的疫苗,就無需對(duì)每批疫苗進(jìn)行免疫攻毒效力檢驗(yàn)。最小免疫劑量的試驗(yàn)方法如下:用不同劑量的疫苗分別接種動(dòng)物,經(jīng)一定時(shí)間后進(jìn)行攻毒或采用已經(jīng)證明與免疫攻毒方法具有平行關(guān)系的替代方法進(jìn)行免疫效力試驗(yàn),統(tǒng)計(jì)出使動(dòng)物獲得較好保護(hù)力(通常應(yīng)達(dá)到 80% ~ 100% )的最低的疫苗接種量,就是最小免疫劑量。如果疫苗使用對(duì)象包括多種動(dòng)物或多種日齡動(dòng)物,則應(yīng)針對(duì)各種或各日齡段靶動(dòng)物測(cè)定最小免疫劑量。 (三) 免疫產(chǎn)生期及免疫持續(xù)期試驗(yàn) 1．用實(shí)驗(yàn)室疫苗制品接種一定數(shù)量的動(dòng)物。接種后,每隔一定時(shí)間,用攻毒用強(qiáng)毒對(duì)一定數(shù)量的免疫動(dòng)物和未接種的對(duì)照動(dòng)物同時(shí)進(jìn)行攻毒或采用已經(jīng)確認(rèn)與攻毒保護(hù)率具有平行關(guān)系的血清學(xué)方法測(cè)定抗體水平,觀察其產(chǎn)生免疫力的時(shí)間、免疫力達(dá)到高峰期的時(shí)間及高峰期持續(xù)時(shí)間。以接種后最早出現(xiàn)良好免疫力的時(shí)間為該疫苗制品的免疫產(chǎn)生期,以接種后保持良好免疫力的最長(zhǎng)時(shí)間為免疫持續(xù)期。 2． 如果是季節(jié)性疾病,只要能夠證明疫苗的免疫力能持續(xù)到接種后的一年中疾病的自然發(fā)生期末。不論是否進(jìn)行加強(qiáng)免疫接種,均應(yīng)提出在此后一年(或幾年)的發(fā)病季節(jié)中的免疫力情況。 3． 免疫期試驗(yàn)應(yīng)在嚴(yán)格控制的實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。若因免疫期過長(zhǎng)、人工飼養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物影響過大等原因?qū)е乱延袑?shí)驗(yàn)室條件不足以滿足整個(gè)免疫期內(nèi)的試驗(yàn),則可在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行免疫期驗(yàn)證。在進(jìn)行臨床免疫期試驗(yàn)的過程中,應(yīng)確保疫苗接種的靶動(dòng)物不發(fā)生并發(fā)性感染,有必要設(shè)同池未接種的靶動(dòng)物作對(duì)照(哨兵動(dòng)物),以監(jiān)視動(dòng)物是否受到田間感染。 4． 主動(dòng)免疫的免疫期通常是指用受試疫苗進(jìn)行一次接種后提供的保護(hù)作用的持續(xù)期。通常應(yīng)在所推薦的加強(qiáng)接種開始的時(shí)間之前,對(duì)接種過的動(dòng)物進(jìn)行攻毒來確定。 5． 如有充分的試驗(yàn)依據(jù)證明適當(dāng)指標(biāo)(如抗體水平)與靶動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)率間存在良好的定性或定量關(guān)系,則可用替代指標(biāo)來衡量疫苗接種后的免疫力。 6． 通常情況下,不接受用非靶動(dòng)物試驗(yàn)獲得的免疫期試驗(yàn)數(shù)據(jù)。 (四)血清學(xué)效力檢驗(yàn)與靶動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)相關(guān)性的研究 當(dāng)成品的效力檢驗(yàn)中采用血清學(xué)方法測(cè)定免疫動(dòng)物抗體反應(yīng),而不采用免疫攻毒試驗(yàn)時(shí),應(yīng)事先進(jìn)行平行關(guān)系驗(yàn)證試驗(yàn),以證明選用該血清學(xué)方法的科學(xué)性。具體試驗(yàn)方法是:用不同劑量的受試疫苗免疫接種動(dòng)物,以便獲得具有不同抗體水平的動(dòng)物,根據(jù)抗體水平的高低,將動(dòng)物分為若干組,用已經(jīng)選定的強(qiáng)毒株按照預(yù)定劑量進(jìn)行攻毒。對(duì)抗體水平與攻毒保護(hù)率之間的關(guān)系進(jìn)行分析。 (五) 不同血清型或亞型間的交叉保護(hù)力試驗(yàn) 有些傳染病病原存在多個(gè)血清型或血清亞型,應(yīng)進(jìn)行交叉保護(hù)力試驗(yàn)。其方法為:用推薦使用劑量疫苗接種一定數(shù)量的動(dòng)物,在產(chǎn)生免疫力后,分別用不同血清型或血清亞型的強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒,觀察其交叉保護(hù)力。通過本試驗(yàn)篩選疫苗菌(毒、蟲)株,并為合理使用疫苗提供依據(jù)。 (六) 替代動(dòng)物的 效力檢驗(yàn)與靶動(dòng)物效力檢驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性的研究 一些制品的效力檢驗(yàn)用靶動(dòng)物來源困難、費(fèi)用高,可使用替代動(dòng)物,但應(yīng)進(jìn)行靶動(dòng)物與替代動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)力平行關(guān)系的試驗(yàn)研究,證明具有平行關(guān)系者,方可用替代動(dòng)物代替靶動(dòng)物。 (七) 不同接種途徑對(duì)靶動(dòng)物的效力試驗(yàn) 水生動(dòng)物疫苗的接種途徑主要包括注射、口服和浸泡等。根據(jù)制品的種類、特點(diǎn),以及相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù),選用合適的接種途徑作為推薦接種途徑。 (八) 接種后動(dòng)物體內(nèi)抗體消長(zhǎng)規(guī)律的研究 免疫動(dòng)物后,定期采血測(cè)定免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體的最早時(shí)間、抗體高峰期、抗體持續(xù)期,為制定免疫程序提供依據(jù)。 上述實(shí)驗(yàn)室效力試驗(yàn)項(xiàng)目中,第(一)、(二)、(三)通常是必不可少的,第(四)、(五)、(六)、(七)、(八)項(xiàng)有時(shí)不是必須的,應(yīng)根據(jù)制品的種類、性質(zhì)、靶動(dòng)物、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等具體情況選擇進(jìn)行。第(一)項(xiàng)通常是成品效力檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的最直接依據(jù),應(yīng)有連續(xù) 3 批實(shí)驗(yàn)室制品的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
